Logaritemska redukcija v challenge testu in testni mikroorganizmi

Odprite katero koli poročilo o challenge testu in našli boste dvoje: seznam mikroorganizmov z latinskimi imeni in stolpec številk, imenovanih logaritemske redukcije. Oboje odloča, ali izdelek test opravi, vendar le malo lastnikov znamk izve, kaj pomenijo. Logaritemska redukcija v challenge testu je zmanjšanje števila živih mikroorganizmov, izraženo v potencah števila deset: 1 log pomeni 90 % manj, 2 log 99 % manj in 3 log 99,9 % manj kot na začetku. Ta vodnik razloži izračun s primeri, predstavi pet testnih mikroorganizmov in pokaže, kako številke brati, ne da bi vas zavedle.

Kratek odgovor

Pri challenge testu laboratorij v ločene dele izdelka doda veliko, znano število mikroorganizmov, običajno od nekaj sto tisoč do milijon na gram. Nato prešteje preživele po 7, 14 in 28 dneh. Vsako štetje pretvori v logaritem in ga odšteje od začetne vrednosti. Rezultat, logaritemsko redukcijo, primerja z merili standarda, običajno ISO 11930. Bakterije morajo upadati najhitreje, kvasovke počasneje, plesni pa najmanj, ker se vsaka skupina vede drugače.

Kaj »logaritemska redukcija« v resnici pomeni

Števila mikroorganizmov segajo čez ogromne razpone, od milijonov do peščice. Če jih zapišemo kot potence števila deset, jih lažje primerjamo: 1.000.000 je 10 na 6, torej log 6, 1.000 pa log 3. Logaritemska redukcija je preprosto začetni log minus log na dan vzorčenja.

• 1 log redukcije = 90 % manj živih mikroorganizmov
• 2 log = 99 % manj
• 3 log = 99,9 % manj
• 4 log = 99,99 % manj

Odstotki zakrijejo, kako velike so razlike. »Uniči 99 %« zveni odlično, a gre le za 2 log, in od milijona začetnih celic jih ostane živih še 10.000. Zato standardi uporabljajo logaritme in ne odstotkov.

Preberite tudi Kaj je kozmetični challenge test? Test učinkovitosti konzervansov razložen

Primer izračuna

Recimo, da laboratorij losjon inokulira s Pseudomonas aeruginosa in je začetno število 500.000 kolonijskih enot (CFU) na gram. Log od 500.000 je 5,7. Sedmi dan je število 200 CFU/g, torej log 2,3. Logaritemska redukcija je 5,7 − 2,3 = 3,4. Po merilih A standarda ISO 11930 morajo bakterije do 7. dne upasti za najmanj 3 log, zato ta rezultat izpolnjuje zahtevo za ta dan.

Zdaj plesen. Aspergillus brasiliensis začne pri 200.000 CFU/g (log 5,3) in je 28. dan pri 15.000 CFU/g (log 4,2). Redukcija je 1,1 log. Za plesni merila A zahtevajo, da 14. dan ni povečanja, do 28. dne pa najmanj 1 log, zato je tudi ta rezultat skladen, čeprav tesno.

Pet testnih mikroorganizmov in zakaj se uporabljajo

ISO 11930, Ph. Eur. 5.1.3 in USP 51 uporabljajo istih pet organizmov. Laboratoriji jih pridobijo iz priznanih zbirk kultur, na primer seve ATCC, da so rezultati primerljivi po vsem svetu.

• Pseudomonas aeruginosa (pogosto ATCC 9027): po Gramu negativna bakterija, ki uspeva v vodi, prenaša veliko konzervansov in lahko povzroči okužbe oči. Je eden najpogostejših vzrokov za težave z onesnaženjem.
• Staphylococcus aureus (pogosto ATCC 6538): po Gramu pozitivna bakterija na koži in v nosu, ki predstavlja onesnaženje z rok in uporabnikov.
• Escherichia coli (pogosto ATCC 8739): po Gramu negativna bakterija in kazalnik fekalnega onesnaženja ter slabe higiene.
• Candida albicans (pogosto ATCC 10231): kvasovka, ki predstavlja glivično onesnaženje, ki v tekočinah raste podobno kot bakterije.
• Aspergillus brasiliensis (pogosto ATCC 16404, prej A. niger): plesen, ki tvori odporne spore in se na konzervanse odziva najpočasneje.

Zakaj imajo bakterije, kvasovke in plesni različne cilje

Bakterije se v izdelkih na vodni osnovi hitro razmnožujejo, zato jih mora konzervansni sistem hitro zmanjšati; zato merila A po ISO 11930 zahtevajo 3 log do 7. dne. Kvasovke je težje uničiti, zato je cilj v enakem času 1 log. Spore plesni so ustvarjene za preživetje v neugodnih razmerah, zato je zahteva nižja: brez povečanja 14. dan in najmanj 1 log do 28. dne po merilih A. Merila B te cilje omilijo in so sprejemljiva le z dokumentirano utemeljitvijo, na primer z zaščitno embalažo.

Preberite tudi Cena challenge testa: kaj vpliva na ceno

Kaj pomeni »brez povečanja«

Štetje kolonij na ploščah nikoli ni povsem natančno. Dve plošči iz istega vzorca se lahko razlikujeta, zato standardi dopuščajo določeno toleranco. USP 51 na primer opredeli »brez povečanja« kot največ 0,5 log nad primerjalno vrednostjo. V praksi število plesni, ki se premakne z log 5,3 na log 5,5, velja za stabilno, skok na log 6,0 pa je dejansko povečanje in s tem neuspeh.

Meje zaznavnosti in rezultati »manj kot«

Ko konzervans dobro deluje, lahko število pade pod mejo, ki jo metoda še zazna. Poročilo takrat pokaže vrednost, kot je »<10 CFU/g«, in logaritemsko redukcijo, zapisano kot »>4,7«. To ne pomeni, da je izdelek sterilen, ampak da so preživeli pod mejo zaznavnosti, ki je odvisna od redčenja in uporabljenega nevtralizatorja. Rezultat »več kot« je dobra novica, vendar točne številke ni mogoče primerjati med poročili z različnimi mejami zaznavnosti.

Zakaj je začetno število pomembno

Vsaka logaritemska redukcija se izračuna glede na referenco. Odvisno od metode je to izračunani inokulum ali štetje takoj po inokulaciji. Laboratorij preveri tudi, ali nevtralizator ustavi delovanje konzervansa na plošči. Če nevtralizacija odpove, konzervans med štetjem še naprej ubija in rezultat je videti boljši, kot je. Vprašajte, ali je bila nevtralizacija preverjena, zlasti pri izdelkih z močnimi konzervansi ali veliko alkohola.

Preberite tudi Moj izdelek ni opravil challenge testa: kaj storiti

Kaj vpliva na logaritemsko redukcijo vašega izdelka

• Izbira in koncentracija konzervansa: vsak konzervans drugače pokriva bakterije, kvasovke in plesni.
• pH: številne organske kisline delujejo le pri nizkem pH. Premik pH med skladiščenjem jih lahko oslabi, kar je eden od razlogov za test stabilnosti.
• Aktivnost vode in formula: emulzije, zgoščevala, rastlinski izvlečki in nekatere površinsko aktivne snovi lahko konzervanse vežejo ali inaktivirajo.
• Embalaža: najbolje je testirati končno formulo v končni embalaži.
• Začetna kakovost: onesnažena serija začne test z dodatnim bremenom. Test mikrobioloških specifikacij potrdi, da je bila serija čista.

Logaritemska redukcija ni rok uporabnosti

Challenge test pokaže, ali konzervansni sistem obvlada onesnaženje v določenem trenutku, običajno na sveži seriji. Ne pove, kako dolgo izdelek ostane stabilen ali kateri rok uporabe po odprtju (PAO) natisniti. Rok uporabnosti izhaja iz testov stabilnosti, nekateri ocenjevalci pa zahtevajo tudi challenge test ob koncu skladiščenja, da pokaže, da konzervans po mesecih na polici še deluje.

Pogoste napačne razlage

• Odstotki kot dokaz. »99-odstotna redukcija« je le 2 log.
• Branje samo 28. dne. Bakterije morajo doseči tudi cilj 7. ali 14. dne.
• Majhna redukcija plesni kot neuspeh. Pri plesnih je lahko »brez povečanja« 14. dan povsem skladno.
• Primerjava poročil brez konteksta. Različni standardi, meje zaznavnosti in inokulumi spremenijo številke.

Pogosta vprašanja

Ali je večja logaritemska redukcija vedno boljša?

V razumnih mejah da, ker kaže varnostno rezervo. Zelo agresiven konzervansni sistem pa lahko odpre vprašanja prenašanja na koži, zato je cilj zanesljiv uspeh, ne največje možno uničenje.

Zakaj je cilj za plesni tako nizek?

Spore plesni so naravno odporne in se odzivajo počasi. Standardi upoštevajo to biologijo, a še vedno zahtevajo, da plesen v izdelku nikoli ne raste.

Kam gre rezultat?

Podpisano poročilo gre v informacijsko datoteko o izdelku (PIF), ocenjevalec varnosti pa ga uporabi v delu A poročila CPSR.

Ključne ugotovitve

• Vsak log je desetkratno zmanjšanje: 3 log pomenijo 99,9 % manj mikroorganizmov.
• Logaritemska redukcija = log začetnega števila minus log števila na dan vzorčenja.
• Pet referenčnih mikroorganizmov pokriva po Gramu negativne in pozitivne bakterije, kvasovke in plesni.
• Cilji se razlikujejo po skupinah, vrednosti »<« pa odražajo meje zaznavnosti, ne sterilnosti.