Logaritmický pokles v záťažovom teste a testovacie mikroorganizmy

Otvorte ktorýkoľvek protokol zo záťažového testu konzervácie a nájdete v ňom dve veci: zoznam mikroorganizmov s latinskými názvami a stĺpec čísel nazývaných logaritmický pokles. Obe rozhodujú o tom, či váš výrobok obstojí, a predsa sa majitelia značiek len zriedka dozvedia, čo znamenajú. Logaritmický pokles v záťažovom teste je úbytok živých mikroorganizmov vyjadrený v mocninách desiatich: 1 log znamená o 90 % menej, 2 log o 99 % menej a 3 log o 99,9 % menej než na začiatku. Tento sprievodca vysvetľuje matematiku na príkladoch, predstavuje päť testovacích organizmov a ukazuje, ako čítať čísla, aby ste sa nenechali zmiasť.

Stručná odpoveď

V záťažovom teste laboratórium pridá veľký, presne známy počet mikroorganizmov do samostatných porcií vášho výrobku, typicky v rádovo státisícoch až milióne na gram. Potom spočíta prežívajúce po 7, 14 a 28 dňoch. Každý počet sa prevedie na logaritmus a odpočíta od východiskovej hodnoty. Výsledok, logaritmický pokles, sa porovná s kritériami normy, zvyčajne ISO 11930. Baktérie musia klesať najrýchlejšie, kvasinky pomalšie a plesne najmenej, pretože každá skupina sa správa inak.

Čo „logaritmický pokles“ skutočne znamená

Počty mikroorganizmov sa pohybujú v obrovských rozsahoch, od miliónov po hŕstku. Zápis v mocninách desiatich uľahčuje ich porovnanie: 1 000 000 je 10 na šiestu, zapísané ako log 6, a 1 000 je log 3. Logaritmický pokles je jednoducho počiatočný log mínus log v deň odberu vzorky.

• Pokles o 1 log = o 90 % menej živých mikroorganizmov
• 2 log = o 99 % menej
• 3 log = o 99,9 % menej
• 4 log = o 99,99 % menej

Percentá zakrývajú, aké veľké sú rozdiely. „Usmrtených 99 %“ znie skvele, ale je to len 2 log a z milióna počiatočných buniek to stále znamená 10 000 živých. Preto normy používajú logaritmy, nie percentá.

Prečítajte si aj Čo je kozmetický challenge test? Test účinnosti konzervácie jednoducho

Príklad výpočtu

Predpokladajme, že laboratórium zaočkuje mlieko kmeňom Pseudomonas aeruginosa a počiatočný počet je 500 000 jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) na gram. Logaritmus 500 000 je 5,7. Siedmy deň je počet 200 CFU/g, teda log 2,3. Logaritmický pokles je 5,7 − 2,3 = 3,4. Podľa kritérií A ISO 11930 musia baktérie do 7. dňa klesnúť aspoň o 3 log, takže tento výsledok požiadavku pre daný deň spĺňa.

Teraz plesň. Aspergillus brasiliensis začína na 200 000 CFU/g (log 5,3) a 28. deň je na 15 000 CFU/g (log 4,2). Pokles je 1,1 log. Pri plesniach požadujú kritériá A žiadny nárast 14. deň a pokles aspoň o 1 log do 28. dňa, takže aj toto vyhovie, hoci len tesne.

Päť testovacích mikroorganizmov a prečo sa používajú

ISO 11930, Ph. Eur. 5.1.3 aj USP 51 používajú tých istých päť organizmov. Laboratóriá ich získavajú z uznávaných zbierok kultúr, napríklad kmene ATCC, aby boli výsledky porovnateľné na celom svete.

• Pseudomonas aeruginosa (často ATCC 9027): gramnegatívna baktéria, ktorá prospieva vo vode, znáša mnohé konzervačné látky a môže spôsobiť očné infekcie. Patrí k najčastejším príčinám problémov s kontamináciou.
• Staphylococcus aureus (často ATCC 6538): grampozitívna baktéria prenášaná na koži a v nose, predstavujúca kontamináciu z rúk a od používateľov.
• Escherichia coli (často ATCC 8739): gramnegatívna baktéria a indikátor fekálnej kontaminácie a zlej hygieny.
• Candida albicans (často ATCC 10231): kvasinka predstavujúca hubovú kontamináciu, ktorá v kvapalinách rastie ako baktérie.
• Aspergillus brasiliensis (často ATCC 16404, predtým A. niger): plesň tvoriaca odolné spóry, ktorá na konzervačné látky reaguje najpomalšie.

Prečo majú baktérie, kvasinky a plesne rôzne ciele

Baktérie sa v prípravkoch na vodnej báze rýchlo množia, takže konzervačný systém ich musí rýchlo potlačiť; preto kritériá A podľa ISO 11930 žiadajú 3 log do 7. dňa. Kvasinky sa ťažšie ničia, takže cieľom je 1 log v rovnakom čase. Spóry plesní sú stavané na prežitie nepriaznivých podmienok, preto je požiadavka nižšia: žiadny nárast 14. deň a pokles aspoň o 1 log do 28. dňa podľa kritérií A. Kritériá B tieto ciele zmierňujú a prijímajú sa len s doloženým odôvodnením, napríklad pri ochrannom obale.

Prečítajte si aj Cena challenge testu: čo ovplyvňuje výšku ceny

Čo znamená „žiadny nárast“

Počítanie kolónií na platniach nikdy nie je dokonale presné. Dve platne z rovnakej vzorky sa môžu líšiť, a preto normy pripúšťajú určitú toleranciu. USP 51 napríklad definuje „žiadny nárast“ ako najviac 0,5 log nad porovnávacou hodnotou. V praxi sa počet plesní, ktorý sa zmení z log 5,3 na log 5,5, považuje za stabilný, zatiaľ čo skok na log 6,0 je skutočný nárast a nevyhovenie.

Medze detekcie a výsledky „menej ako“

Keď konzervačná látka funguje dobre, počet môže klesnúť pod hodnotu, ktorú metóda dokáže zistiť. Protokol potom uvedie hodnotu ako „<10 CFU/g“ a logaritmický pokles zapíše ako „>4,7“. Neznamená to, že je výrobok sterilný; znamená to, že prežívajúce sú pod medzou detekcie, ktorá závisí od riedenia a použitého neutralizačného činidla. Výsledok „viac ako“ je dobrá správa, ale presné číslo sa nedá porovnávať medzi protokolmi s rôznymi medzami detekcie.

Prečo záleží na počiatočnom počte

Každý logaritmický pokles sa počíta voči referencii. Podľa metódy je to vypočítané inokulum alebo počet zistený hneď po zaočkovaní. Laboratórium tiež overuje, že jeho neutralizačné činidlo zastaví pôsobenie konzervačnej látky na platni. Ak neutralizácia zlyhá, konzervačná látka počas počítania ďalej ničí mikroorganizmy a výsledok vyzerá lepšie, než v skutočnosti je. Opýtajte sa, či bola neutralizácia overená, najmä pri výrobkoch so silnými konzervačnými látkami alebo vysokým obsahom alkoholu.

Prečítajte si aj Môj výrobok neobstál v challenge teste: čo robiť ďalej

Čo ovplyvňuje logaritmický pokles vášho výrobku

• Voľba a množstvo konzervačnej látky: každá konzervačná látka pokrýva baktérie, kvasinky a plesne inak.
• pH: mnohé organické kyseliny pôsobia len pri nízkom pH. Posun pH počas skladovania ich môže oslabiť, čo je jeden z dôvodov vykonať test stability.
• Aktivita vody a receptúra: emulzie, zahusťovadlá, rastlinné extrakty a niektoré tenzidy môžu konzervačné látky viazať alebo inaktivovať.
• Obal: test je najlepšie vykonať na finálnej receptúre v konečnom obale.
• Východisková kvalita: kontaminovaná šarža začína test s dodatočnou záťažou. Test mikrobiologických špecifikácií potvrdí, že šarža bola čistá.

Logaritmický pokles nie je trvanlivosť

Záťažový test ukazuje, či si konzervačný systém poradí s kontamináciou v jednom okamihu, zvyčajne na čerstvej šarži. Nehovorí, ako dlho zostane výrobok stabilný ani aké obdobie použiteľnosti po otvorení (PAO) uviesť. Trvanlivosť vyplýva z testov stability a niektorí posudzovatelia žiadajú aj záťažový test na konci skladovania, aby sa preukázalo, že konzervačná látka funguje aj po mesiacoch na regáli.

Časté nesprávne výklady

• Čítanie percent ako dôkazu. „99 % pokles“ je len 2 log.
• Čítanie iba 28. dňa. Baktérie musia splniť aj cieľ 7. alebo 14. dňa.
• Považovanie malého poklesu plesní za nevyhovenie. Pri plesniach môže byť žiadny nárast 14. deň plne vyhovujúci.
• Porovnávanie protokolov bez kontextu. Rôzne normy, medze detekcie a úrovne inokula čísla menia.

Často kladené otázky

Je vyšší logaritmický pokles vždy lepší?

V rozumných medziach áno, pretože ukazuje bezpečnostnú rezervu. Veľmi agresívny konzervačný systém však môže vyvolať obavy z hľadiska znášanlivosti, takže cieľom je spoľahlivé vyhovenie, nie maximálny možný účinok.

Prečo je cieľ pre plesne taký nízky?

Spóry plesní sú prirodzene odolné a reagujú pomaly. Normy túto biológiu odrážajú a pritom stále vyžadujú, aby plesň vo výrobku nikdy nerástla.

Kam výsledok putuje?

Podpísaný protokol patrí do súboru informácií o výrobku (PIF) a posudzovateľ bezpečnosti ho využíva v časti A CPSR.

Hlavné poznatky

• Každý log je desaťnásobný pokles: 3 log znamená o 99,9 % menej mikroorganizmov.
• Logaritmický pokles = log počiatočného počtu mínus log počtu v deň odberu vzorky.
• Päť referenčných organizmov pokrýva gramnegatívne a grampozitívne baktérie, kvasinky a plesne.
• Ciele sa líšia podľa skupiny organizmov a hodnoty „<“ odrážajú medze detekcie, nie sterilitu.